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MIRNA提取试剂盒的应用!百欧博伟生物


一、背景


MIRNA提取试剂盒专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA,还可以提取siRNA,snRNA等其他小于200nt的小分子RNA,同时也可用于总RNA的提取。


本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合,独特的裂解液在有效抑制RNases的同时,可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中,如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。


本品适用样本范围广,制备的RNA纯度高,可直接用于敏感的下游应用,如Northern Blot分析,Real-Time PCR,Microarray Analysis等。


MicroRNA是一类在进化上高度保守、在生命有机体的发育过程中具有重要的调控功能的非编码小分子RNA,大小约为18-22个碱基。miRNA通过与靶基因的3’非翻译区完全或者不完全的碱基互补配对结合,发挥对靶基因mRNA的抑制或者转录后调控使功能蛋白降解的作用。在动物的胚胎早期发育、动植物细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程中,MicroRNA都发挥着极其重要的作用。


样品处理:


①组织:将组织在液氮中磨碎。每30-50 mg组织加1ml TRIzon Reagent,震荡混匀。样品体积不超过TRIzon Reagent体积的十分之一。


②单层培养细胞:吸去培养液,加入TRIzon Reagent,每10cm2加入1ml TRIzon Reagent(裂解液用量视培养瓶面积而定)。


③细胞悬液:离心得到细胞沉淀,弃上清。每5×106-1×107细胞加入1ml TRIzon Reagent(细胞不需洗涤)。


④血浆或血清:取200μl血浆或血清样本,加入5倍体积TRIzon Reagent,震荡混匀30秒。


二、应用


用于猪骨骼肌发育中相关miRNA的鉴定及miR-21生物学功能研究:


利用小鼠成肌细胞系C2C12过表达或抑制miR-21,首次发现并证实了miR-21能显著促进成肌细胞的增殖。随后,利用生物信息学方法预测并鉴定出miR-21的一个靶标基因TGFBI,提示miR-21是通过调控TGFB/AKT-mToR信号通路调控骨骼肌的发育。


首先在小鼠个体水平上检测了miR-21的表达水平,随后建立了C2C12细胞体外分化模型,通过对miRNA-21在分化0天、1天、3天和5天表达量的定量检测,发现miRNA-21在C2C12分化过程中表达显著下降。


应用免疫荧光检测方法分析miRNA-21对C2C12细胞增殖的作用,结果表明过表达以后48小时miRNA-21显著促进了细胞的增殖;而抑制掉miRNA-21之后,细胞的生长于48小时明显减缓,表现为有丝分裂marker基因P-H3的变化上。利用TargetScan和miRanda软件对miRNA-21的靶标进行预测,筛选出TGFBI基因(transforming growth factor induced gene)。


通过双荧光素酶报告基因实验确定了TGFBI的3’UTR(非翻译区)含有miRNA-21的结合点,同时运用qRT-PCR和western blot验证了miRNA-21在蛋白质翻译水平抑制TGFBI的表达,而不影响mRNA水平表达。


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